酵母基因组DNA提取试剂盒（离心吸附柱法)

产品货号：

WH0020

中文名称：

酵母基因组DNA提取试剂盒（离心吸附柱法)

英文名称：

Extraction kit for genomic DNA from yeast

产品规格：

50次

发货周期：

1～3天

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本试剂盒采用高效、专一结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母菌基因组DNA，样品裂解后，DNA在高盐条件下与硅胶膜特异结合，在低盐、高pH值时DNA从硅胶膜上洗脱下来。纯化过的基因组DNA可直接用作PCR模板、酶切、杂交等分子生物学实验。

产品特点

操作简单、快速：1h内即可获得高质量的酵母基因组DNA。
无毒害：无需使用酚、氯仿等有害试剂，操作安全。
纯度高：可直接用于PCR、酶切、杂交等分子生物学实验。

组分	规格
缓冲液GA	15mL
缓冲液GB	15mL
缓冲液GD	13mL
漂洗液PW	15mL
洗脱缓冲液TE	15mL
Proteinase K(20mg/mL)	1mL
吸附柱CB3	50个
收集管(2mL)	50个

保存条件：室温（15～25℃）干燥条件下，可保存12个月，更长时间的保存可置于2～8℃。2～8℃保存条件下，若溶液产生沉淀，使用前应将试剂盒内的溶液在室温放置一段时间，必要时可在37℃水浴中预热10min，以溶解沉淀。

自备试剂

RNase A（100mg/ml，推荐货号：WH0217）
Lyticase（推荐货号：WH0216）
山梨醇buffer

菌体浓度检测：
可采用分光光度计或平板培养法检测菌体量，一般对于酿酒酵母，OD600值为1.0时，相当于1～2×10⁷cells/ml。

（请务必在使用本试剂盒之前阅读此注意事项)

样品应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量也下降。
若缓冲液GA或GB中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，并摇匀后使用。
所有的离心步骤均为使用台式离心机在室温下进行。

使用前请先在缓冲液GD和漂洗液PW中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶上的标签。

取酵母细胞（最多不超过5×10⁷cells），12000rpm（~13400×g)离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。
酵母细胞壁的破除：
酶法：向菌体中加入600μL山梨醇buffer，加入大约50U Lyticase(自备)，充分混匀。30℃处理30min。4000rpm（~1500×g)离心10min，弃上清，收集沉淀。
注意：以上为5×10⁷酵母细胞的Lyticase用量，根据酵母的菌株和酵母细胞数量的不同，所用Lyticase的浓度和孵育时间应该进行适当调整。
向沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬沉淀，充分混匀。
如果需要去除RNA，可加入4μL RNase A（100mg/ml）溶液（自备），振荡15sec，室温放置5min。
加入20μL Proteinase K溶液，混匀。
加入220μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取的DNA不纯。
加220μL无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm（~13400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
重复操作步骤9。
将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm（~13400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50～200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5min，12000rpm（~13400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中。
注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm （~13400×g)离心2min。洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。若用ddH2O做洗脱液应保证其pH值在7.0～8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。

DNA浓度及纯度检测：

得到的基因组DNA片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。回收得到的DNA片段可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。
DNA应在OD₂₆₀处有显著吸收峰，OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/mL双链DNA、40μg/mL单链DNA。
OD₂₆₀/OD₂₈₀比值应为1.7～1.9，如果洗脱时不使用洗脱缓冲液，使用ddH2O，比值会偏低，因为pH值和离子存在会影响光吸收值，但并不表示纯度低。

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